Co je syntéza peptidů

 

Syntéza peptidů je aktivní pole v chemii proteinů a peptidů, které typicky zahrnuje postupné přidávání aminokyselin v definovaném pořadí za vytvoření peptidového řetězce chemickými metodami. Hlavními metodami syntézy jsou syntéza v kapalné fázi a syntéza v pevné fázi. Ve srovnání s LPPS má SPPS výhody v tom, že je rychlejší, jednodušší, s méně vedlejšími reakcemi a vyššími výtěžky.

 

Standardní metoda SPPS, včetně strategií Boc (benzyl) a Fmoc (tBu).

 

 

Strategie Boc (benzyl).

V tomto syntetickém přístupu se jako pevné nosiče používají chlormethylované, hydroxymethylované polystyrenové a p-methoxybenzylové (PMA) pryskyřice. -aminoskupina je chráněna t-butoxykarbonylem (Boc), zatímco skupiny postranních řetězců aminokyselin jsou chráněny benzylovými deriváty. Skupina Boc se odstraní použitím čisté TFA nebo TFA v CH2CI2 a na konci syntézy se ochranné skupiny postranního řetězce a vazby peptid-pryskyřice odstraní silnou kyselinou, jako je bezvodá kyselina fluorovodíková (HF) nebo TFMSA.

 

Strategie Fmoc (tBu).

V tomto syntetickém přístupu se jako pevné nosiče používají pryskyřice Wang-pryskyřice, 2-chlortritylchloridová pryskyřice, Rink amid-AM pryskyřice, Rink amid-MBHA pryskyřice. -aminoskupina je chráněna 9-fluorenylmethoxykarbonylem (Fmoc ), zatímco skupiny postranních řetězců aminokyselin jsou chráněny v kyselém prostředí labilními chránícími skupinami. Skupina Fmoc se odstraní pomocí 20% piperidinu v DMF a na konci syntézy se ochranné skupiny postranního řetězce a vazby peptid-pryskyřice odstraní 1%-95% TFA. Fmoc SPPS je v současnosti preferovanou metodou pro syntézu peptidů.

 

Základní principy syntézy peptidů na pevné fázi Fmoc

 

Vyberte Pryskyřici

Nejčastěji používané pryskyřice v Fmoc SPPS včetně 4-Alkoxybenzylalkoholové (Wang) pryskyřice, 2-chlortritylchloridové pryskyřice, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA pryskyřice. Amidové pryskyřice se používají pro syntézu peptidů s požadovanou C-koncovou amidací. Pryskyřice Wang a pryskyřice 2-Cl Trt se běžně používají pro syntézu peptidu s požadovaným C-koncovým volným COOH. Ale když C-konec peptidu obsahuje Pro a Gly jako první aminokyselinu, Wangova pryskyřice by se neměla používat kvůli riziku tvorby DKP (diketopiperazinu), k použití se doporučuje 2-Chlorotrityl Chlorid Resin.

 

 

Připojení chráněných aminokyselin k pryskyřicím

První Fmoc aminokyselina je připojena k nerozpustné nosné pryskyřici prostřednictvím kyselého labilního linkeru.

 

Odstranění chránící skupiny -aminoskupiny

Dočasná Fmoc chránící skupina na N-konci peptidyl-pryskyřice se odstraní působením roztoku 20% piperidinu v DMF. Tato reakce obvykle skončí během 10 až 20 minut.

 

Kroky mytí

Po každé chemické reakci se provádějí promývací kroky k odstranění přebytečných činidel, vedlejších produktů a nezreagovaných molekul z pryskyřice. To pomáhá udržovat čistotu rostoucího peptidového řetězce.

 

Aktivace a spojení chráněné aminokyseliny

Chráněná aminokyselina navázaná na pryskyřici se aktivuje, aby se zvýšila její reaktivita pro spojení s další aminokyselinou v sekvenci. Mezi běžné aktivační látky patří HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU a HATU. Vazba zahrnuje vytvoření peptidové vazby mezi aktivovanou aminokyselinou a aminoskupinou rostoucího peptidového řetězce. Ke sledování úplnosti kopulačních reakcí se obvykle používá Kaiserův test.

 

Kroky mytí

Podobně jako v dřívějších promývacích krocích to zajišťuje odstranění přebytečných činidel a vedlejších produktů po kopulační reakci.

 

Odštěpení z pryskyřice a odstranění chránících skupin postranního řetězce

Jakmile je požadovaná peptidová sekvence syntetizována na pryskyřici, je odštěpena z pevného nosiče pomocí štěpícího koktejlu, jako je kyselina trifluoroctová (TFA) obsahující lapače, jako je thioanisol a voda. Současně jsou odstraněny chránící skupiny postranního řetězce na aminokyselinových zbytcích, čímž se odhalí zcela zbavený peptid připravený k čištění a analýze.